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測定抗性澱粉含量過程及方式

利用 Resistant Starch assay kit測定抗性澱粉含量

(一) 藥品：

1. 試劑 Reagent
   (1) 馬來酸鈉緩衝溶液（Sodium maleate buffer）
   (2) 醋酸鈉緩衝溶液（pH3.8）（Sodium acetate buffer）
   (3) 醋酸鈉緩衝溶液（pH4.5）（Sodium acetate buffer）
   (4) 氫氧化鉀水溶液（Potassium hydroxide solution）
   (5) 50%酒精（Aqueous ethanel or IMS）
2. 酵素
   (1) 澱粉葡萄糖苷酶（Amyloglucosidase）
   (2) 胰α澱粉酶（Pancreatic α-amylase）
   (3) GOPOD 反應緩衝液（GOPOD Reagent Buffer.）
   (4) GOPOD 反應酵素（GOPOD Reagent Enzymes.）
   (5) 葡萄糖標準液（D-Glucose standard solution）
   (6) 抗性澱粉對照組（Resistant starch control）

(二) 過程（註 1）（一次實驗三重複）

1. 模擬消化道的分解作用

取 0.5 g 樣品至玻璃試管（16✕100 mm），加入 4 mL 的α-amylase 和 Amyloglucosidase，置入恆溫振盪水浴 16 小時（37 ℃，100 rpm/min） 。取出後加入 4 mL 99 %乙醇，均勻混合後離心（5000 rpm，15 min） ，接著傾倒上層液至 50 mL 的離心管，將沉澱物加入 2 mL 的 50 ％酒精後震盪，再加入 6 mL 的 50 ％酒精並混 合均勻離心（5000 rpm，15 min），此步驟重複兩次。

2. 測定抗性澱粉

添加 2 mL 2 M KOH 和攪拌子至試管中，於冰浴中攪拌 20 min，再加入 8 mL 1.2 M 醋酸緩衝溶液（pH 3.8）並以磁力攪拌，立即加入 0.1 mL AMG（將消化酶未 水解的澱粉再強效分解），置於 50 ℃水域中 30 min，接著： If 抗性澱粉 > 10％：需進行稀釋，將試管內容物定量至 100 mL，離心（5000 rpm， 15 min） If 抗性澱粉< 10％：直接離心（5000 rpm，15 min），取 0.1 mL 樣品上清液至試 管，加入 3 mL GOPOD 試劑，在 50 ℃水浴中作用 20 min，取出後，先在吸光值 510 nm 下以空白試劑歸零再測定試樣。

3. 測定非抗性澱粉

將 1.部份最後的總上清液（含澱粉水解後產生的醣類）以醋酸鈉緩衝溶液 （pH 4.5）稀釋 50 mL，取 0.05 mL 的上述溶液和 10 µl 的 Amyloglucosidase 混合，此 步驟重複兩次以分成兩管。加入 3mLGOPOD 試劑，在 50 ℃水浴中作用 20 min，取 出後，先在吸光值 510 nm 下以空白試劑歸零再測定樣品。 ※最後還需要測 D-glucose 標準液的吸光值

(三) 含量計算

1. 抗性澱粉含量

If 樣品含量＞10％ （g /100 g sample）

＝△E × F × 100/0.1 × 1/1000 × 100/W × 162/180

＝△E × F/W × 90 If 樣品抗性澱粉含量＜10％ （g /100 g sample）

＝△E × F × 10.3/0.1 × 1/1000 × 100/W × 162/180 ＝△E × F/W × 9.27

2. 非抗性澱粉含量

＝△E × F × 100/0.1 × 1/1000 × 100/W × 162/180

＝△E × F/W × 90

E：樣品吸光值－空白試劑吸光值

F：將吸光值轉換成葡萄糖標準品 mg

W：分析樣品乾重＝重量×（100－水分含量）/100

100/0.1：稀釋倍數（定量至 100mL 取 0.1mL）

1/1000：由 g 轉換成 mg

100/W：抗性澱粉占樣品重量的百分比的係數

162/180：澱粉中發生游離葡萄糖轉變成無水葡萄糖的係數

10.3/0.1：稀釋倍數